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密度梯度離心機(jī)在試驗(yàn)中應(yīng)該如何進(jìn)行操作?

點(diǎn)擊次數(shù):1649 更新時(shí)間:2019-01-09
  密度梯度離心機(jī)技術(shù)是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心機(jī)技術(shù)常用的介質(zhì)為氯化銫,蔗糖和多聚蔗糖。
 
  密度梯度離心機(jī)試驗(yàn)操作過(guò)程如下:
 
  1、將收集的組織或臟器或其他,用玻璃勻漿器充分研磨后制成懸液,經(jīng)反復(fù)凍融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,備用。
 
  2、先以5000g離心15分鐘后,獲取上清夜,然后再20000g高速離心30分鐘后取上清夜。
 
  3、接著10萬(wàn)g超速離心2h,將沉淀用少量STE溶解。
 
  4、先在超速離心管中加入5-8mL的第3步所獲取的含病毒樣品的溶解液,然后在離心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的時(shí)候是用長(zhǎng)針頭從底部往上加的。11萬(wàn)g離心2.5h,發(fā)現(xiàn)在30 %與45 % 以及45 % 與60 %之間都有一條明亮的帶,用長(zhǎng)針頭將兩條不同部位的帶都吸取出來(lái),分別收集到不同的瓶?jī)?nèi)。
 
  5、去蔗糖;用STE緩沖液適量稀釋純化的病毒,然后11萬(wàn)g離心3h,用少量STE緩沖液把沉淀懸起,即后獲得了純化的病毒。-20度凍純備用,用時(shí)可用分光光度計(jì)測(cè)定其病毒含量。

  密度梯度離心機(jī)分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求:
 
  1、能產(chǎn)生密度梯度,且密度高時(shí),粘度不高。
 
  2、PH中性或易調(diào)為中性。
 
  3、濃度大時(shí)滲透壓不大。
 
  4、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡,在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同區(qū)帶的分離方法。
 
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